冷冻电子断层扫描(CryoET)用于分辨细胞环境内的生物分子，分辨率达到亚纳米级，为研究分子社会学开启了一扇窗。在这一尺度下，仅通过形状就可以识别各个蛋白质，而不需要任何标记。但是，亚纳米分辨率下的成像伴随着一个重大的挑战：您需要找到并准确定位感兴趣的部位。

徕卡显微系统提供冷冻电子断层扫描解决方案，使用冷冻光学显微镜进行快速、高分辨率的成像和准确的图像数据传输，同时在整个工作流程中保持至佳的冷冻条件。

什么是冷冻电子断层扫描？

使用冷冻电子断层扫描（也称为电子断层扫描），可以在原生和功能状态下以三维分子分辨率分析蛋白质间相互作用。样本在一系列受控的位置上倾斜时，会成像为一系列的二维图像。由此产生的图像“切片”可以组合起来，生成样本的三维重建图像。

典型的CryoET工作流程中有哪些挑战？

在典型的CryoET工作流程中，至大挑战是难以确定包含要成像的细胞或蛋白质的准确感兴趣区域。目标定位反复失败会导致过程非常耗时，至终浪费昂贵的电子显微镜(EM)成像时间。工作流程中的另外两个挑战包括确保样本质量和冰层厚度始终如一，以及在将样本传送到冷冻透射电镜之前使样本保持充分玻璃化。

CryoET工作流程包含哪些步骤？

该技术涉及样本的制备，样本在电子显微镜载网上，然后迅速陷入液氮中冷冻，使样本玻璃化，防止冰晶形成。

为了进行高分辨率的冷冻断层扫描，成像的标本切片厚度不应大于300纳米。为了观察样本的“较厚”部分（如细胞体），须将样本减薄。除了冷冻超薄切片技术外，使用专门或多模态的冷冻扫描电子显微镜进行聚焦离子束(FIB)研磨是一种方法。两个离子束窗口的定位应确保在感兴趣区域内形成厚度大约200纳米的薄冰片（薄片），以便进行冷冻电镜电子断层扫描。

现在可以用冷冻透射电子显微镜扫描制备的样本，然后须进行数据重建过程，将二维图像重建为单一的三维模型。

如何用冷冻光学显微镜克服冷冻电子断层扫描(CryoET)的挑战？

冷冻光学显微镜可以在两个重要方面对CryoET工作流程做出积极贡献。

首先，光学显微镜有助于评估样本的质量。使用冷冻光学显微镜可以快速了解样本的冷冻质量和冰层厚度，以及样本的分布是否适合进一步处理。徕卡的冷冻解决方案可确保样本在这些步骤中保持安全和活性。

其次，在提高工作流程效率方面，冷冻光学显微镜的至大潜力是能够在启动时间和成本密集型的冷冻电镜制备工作之前，更加准确地定位感兴趣的结构。徕卡的冷冻光学显微镜解决方案能够将目标结构的图像和坐标输出到后续的电镜步骤，从而显著缩短电镜成像时间。

一个完整载网的焦面总览，有不同的模式来识别载网缺陷、对齐标志和目标分布。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室Mahamid团队的Ievgeniia Zagoriy提供。蓝色–Hoechst，细胞核；绿色–MitoTracker Green，线粒体；红色–Crimson荧光珠和Bodipy，脂滴。一个载网方格的边缘长度：90微米，比例尺宽度：35微米。完整载网直径：3毫米

Coral Cryo简介：迄今至有效的CryoET工作流程

徕卡提供专用的三维冷冻电子断层扫描工作流程解决方案，可确保样本活性、进行质量检查，至重要的是确保三维目标定位机制准确可靠，从而克服各种典型的挑战。我们优化的硬件（包含冷冻台和传送梭）配合CryoET目标定位软件，以及适用于冷冻聚焦离子束(FIB)或真空冷冻传送(VCT)载物台的各种无缝集成和传送选项。

莱茵衣藻，两种不同类型的鞭毛内转运蛋白IFT-NeonGreen和IFT-mCherry。样本由德国德累斯顿马克斯-普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所的Pigino实验室提供。

如何选择：冷冻宽场还是冷冻共聚焦？